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 NISINA AD ALTA POTENZA , LFE

(LFE-15000, LFE-8000, LFE-1000)

 

 

 ABA= acido amino butirrico

DHA= deidroalanina

Ala-S-Ala= lantionina

DHB= deidroabutirina

Aba-S-Ala= B metilantionina

 

Generalità	La Nisina è un batteriocina peptidica policationica  prodotta dalla fermentazione di Lactococcus lactis che agisce su specie batteriche GRAM+ ma anche su GRAM- con opportune associazioni.
Categoria	Biopreservante per alimenti e cosmetici.
Meccanismo d’azione	Agisce interferendo con la parete cellulare o le membrane dei microrganismi bersaglio. Inibizione della biosintesi della parete cellulare, e/o formazione di pori nella parete cellulare. Legame a strutture di membrana (Lipide II) che controllano la sintesi della parete cellulare batterica.
Spettro d’azione	Attivo nei confronti di : Lysteria monocytogenes Staphylococcus aureus Meticillino resistenti Enterococci Vancomicina resistenti Spore di Bacillus e Clostridium Bacillus Subtilis. Bacillus Cereus Lactobacillus fructivorans Salmonella Typhimurium (in associazione con EDTA)
Campi di applicazione	Come conservante per uso alimentare (tofu, succhi di frutta, carne, sughi, birra, pomodoro, pasta, pesce, latte). Uso cosmetico, INCI/CTFA: LACTOCOCCUS FERMENT. Uso veterinario (per trattamento mastite)
Restrizione di utilizzo	E’ efficace e stabile a pH acido (3,5-6,6)
Potenziamento attività	CHELANTI:  Attivo contro i Gram negativi se usato in associazione con  EDTA e esametafosfato di sodio (NaHMP) OLI ESSENZIALI: sinergismo in associazione con oli essenziali (timolo, carvacrolo) ed esteri del saccarosio Calore Atmosfera protettiva
Concentrazioni d’uso	LFE –15000 : 50-100 ppm (prodotti speciali) LFE-8000 : 0,01-0,02 % (uso cosmetico) LFE-1000 : 0.1-0.5 %(conservazione alimentare)
Tossicità e sicurezza d’impiego	Usata ampiamente a partire dal 1953  e riconosciuta sicura da : FSIS ( Food Safety and Inspection Service, USA), US FDA, FAO/OMS, UE (Commissione permanente per alimenti, E234). E’ stato riconosciuto come  GRAS (Generally Recognized As Safe)
Campi di applicazione alimentare	- Coating alimentare contro Salmonella (attivo contro Gram negativi in associazione con EDTA). - Coating su carne bianca contro Listeria monocytogenes (in associazione con acido Laurico). Associazione con esteri della cellulosa e acidi grassi con per Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus.        - In associazione con acido lattico per la conservazione della carne        -  Nisina associata  a  calore  battericida per E. Coli (Gram-).
Altre proprietà	Stabilizzante ed emulsionante per uso alimentare, farmaceutico e cosmetico

 

 

GENERALITA’ Negli ultimi anni si è assistito ad un crescente sforzo finalizzato alla ricerca di nuovi prodotti deputati alla protezione gli alimenti dalla contaminazione microbica. Attualmente esiste una grande varietà di prodotti chimici che si utilizzano nell’industria per la conservazione degli alimenti,[i] ma nonostante la conservazione con sostanze chimiche di sintesi fornisca molti vantaggi, i consumatori sono sempre più attenti agli eventuali effetti tossici. Per queste ragioni, i produttori si indirizzano sempre più, verso la ricerca di sostanze additive alternative, possibilmente di origine naturale, per ridurre o evitare i conservanti chimici tradizionali. Anche se l’ingrediente di origine naturale è generalmente meglio accettato, perché ritenuto binomio di innocuità e sicurezza, tuttavia non è però semplice coniugare, l’origine e la sicurezza, con l’efficacia ed applicabilità nella industrializzazione dei processi di produzione[ii]. I sorbati, ad esempio, sono usati normalmente per combattere funghi e lieviti ma non sono battericidi, e per ampliare lo spettro di attività devono essere associati ad altre sostanze. Come è noto, gli antibiotici vengono prodotti dai microrganismi, batteri, muffe, ecc.., allo scopo di contrastare lo sviluppo di altri microrganismi loro competitori. A questo proposito, un’interessante classe di sostanze é rappresentata dalle batteriocine, piccole proteine con spiccate capacità antimicrobiche prodotte da determinate ceppi di batteri[iii]^,[iv],[v]. L’impiego di batteriocine come biopreservanti è stata ampliamente valutato, e si é dimostrato una strategia efficace nel controlllo dei microorganismi patogenici.[vi] A questo gruppo appartiene  la Nisina, un lantibiotico, costituito da peptidi antimicrobici, caratterizzati dalla presenza dell’amminoacido lantionina, derivante da modificazioni posttraduzionali. La Nisina è una batteriocina prodotta dal ceppo Lactococcus Lactis (microrganismo probiotico) o da Streptococcus Lactis [vii]. Isolata nel 1928, è stata introdotta come antimicrobico in alcuni alimenti negli anni ’50 e da allora si utilizza per il controllo del deterioramento batterico degli alimenti termoelaborati che si conservano a pH acido. E’ un agente antimicrobico efficace contro un’ampia gamma di batteri Gram ⁺, cellule vegetative e spore. 

 

MECCANISMO D’AZIONE : La Nisina è un peptide amfifilico e idrofilo e sono almeno due i meccanismi d’azione ipotizzati ²: nel primo caso si ipotizza che, similmente ai macrolidi polienici, le batteriocine formino nella parete batterica un “poro” nel quale i monomeri delle medesime si uniscono e polimerizzavano con effetto sulla pressione osmotica cellulare. Nel secondo caso si ipotizza che le batteriocine destabilizzino la membrana agendo da tensioattivi[viii]. Nel primo meccanismo si spiega l’influenza del pH sull’azione della Nisina in quanto il legame Nisina-batteri avviene per interazione elettrostatica con la carica negativa dei fosfolipidi di membrana,  seguita da un ri-orientazione che dipende dal potenziale di membrana del microrganismo ². Studi con marcatori fluorescenti hanno dimostrato come il grado di interazione della Nisina con il bilayer lipidico dipenda dalla concentrazione della stessa batteriocina. Il grado di tale binding determina l’efflusso di ATP intracellulare che porta a morte cellulare. Si è potuto inoltre riscontrare che, a pH neutro, si hanno meno molecole di Nisina legate sulla superficie[ix]^,[x]. Recenti studi hanno rivisto però il meccanismo della formazione del poro, che non sembra descrivere adeguatamente il meccanismo delle batteriocine: è stato osservato il binding della Nisina con il lipide II di membrana che controlla la sintesi della parete cellulare [xi].

 

STABILITA’ E CONDIZIONI DI UTILIZZO: La stabilità della molecola, la solubilità e la relativa attività antibatterica sono pH dipendenti, esse diminuiscono all’aumentare del pH. La Nisina ha un punto isoelettrico nel range alcalino, quindi la carica netta sulla superficie della molecola dovrebbe essere più alta a valori di pH acidi che neutri. Il massimo di adsorbimento della Nisina sulle cellule batteriche è stato osservato a pH 6.5, e meno della metà è assorbito a pH 4.4. Queste considerazioni confermano che la Nisina presenta l’attività antimicrobica più alta a pH acido. Infatti in condizioni basiche l’attività si perde rapidamente a causa della vicinanza al punto isoelettrico della proteina (30’, 63°C a pH 11) e questo può rappresentare un limite alle sue possibilità formulative. Per quanto riguarda la termostabilità della Nisina, le soluzioni al 2% sono stabili entro range di temperature che vanno da 2 a 121°C senza perdita di attività. La quantità di Nisina normalmente utilizzata nella conservazione degli alimenti è totalmente solubile in acqua, ma insolubile nei solventi non polari. Si utilizzano normalmente da 50 a 100 g per tonnellata di prodotto[xii].

 

TIPOLOGIA DI ALIMENTI CONSERVABILI Studi recenti hanno dimostrato la capacità conservante della Nisina su un’ampia gamma di prodotti alimentari tra i quali : condimenti a pH acido ^1,2 (maionese, ketch-up, salse) e prodotti come succhi di frutta e sughi. E’ stata utilizzata per la conservazione del tofu, latte fermentato, ricotta e yogurt [xiii], carne [xiv] e soprattutto in oriente per il pesce (salmone affumicato e altre tipologie ittiche associandola ad atmosfera controllata) [xv] e purè di patate, dove è indicata rispetto ad altri conservanti vista la resistenza alla pastorizzazione [xvi].

 

SPETTRO ANTIMICROBICO:  La Nisina è risultata efficace come conservante del deterioramento microbico dato da microrganismi quali la Listeria monocytogenes ^14,16_, Lactobacillus fructivorans ² un microrganismo normalmente presente nelle salse e condimenti, dalle spore di Bacillus Subtilis e Clostridium nella purea di patate ¹⁷,  Staphylococcus aureus meticillino resistenti e Enterococci Vancomicina resistenti[xvii], B. thermosphacta, Lactobacillus sakei, Leuconostoc mesenteroides. L’azione sui Gram^- (Salmonella Typhimurium)  si ottiene con l’associazione ad agenti in grado di allargare il suo spettro come gli agenti sequestranti i metalli (EDTA)[xviii]. Si è dimostrata una delle più efficaci batteriocine nei confronti del Bacillus cereus (Batterio enterotossigeno) che è un noto contaminate dei prodotti per l’infanzia.

 

TECNOLOGIA DELLA CONSERVAZIONE CON NISINA: Applicazioni particolari sono state effettuate nella filmatura, coating per alimenti. Si è dimostrata attiva contro la Salmonella Typhimurium  per la conservazione del pollo, rinforzata dall’uso di chelanti quali l’EDTA (5 mM) e con concentrazioni di Nisina 100, 300 e 500 mg/ml (coating con acido citrico 3%, 0.5% Tween 80  0.5% calcio arginato)¹⁵. In associazione con lisozima è stata utilizzata in via sperimentale nel coating del prosciutto¹⁹. Sono stati realizzati coating con Nisina e acido laurico valutandone l’azione verso la specie microbica Listeria monocytogenes.¹⁹ I film con idrossimetilpropilcellulosa servono per ridurre l’umidità che favorisce la crescita batterica. L’aggiunta di acidi grassi alla Nisina ne migliora le proprietà antimicrobiche¹⁹. Ovviamente tale prodotto non può essere utilizzato, in quanto “ostacolo” alla crescita microbica, in tutti quei prodotti alimentari che necessitano di elaborazione da parte di microrganismi:  maturazione del prosciutto, fermentazione del latte, ecc. ³

 

POTENZIAMENTO D’AZIONE :  La Nisina è in grado di inattivare la flora microbica Gram⁺ in quanto capace di ridurne la permeabilità della membrana citoplasmatica. Al contrario, i batteri Gram^-, possedendo una membrana esterna impermeabile alla Nisina, non ne vengono influenzati. Pertanto, la Nisina, di per sé, non inibisce importanti patogeni quali Escherichia coli, Salmonella spp., Campylobacter spp. e Yersinia enterocolitica, mentre è letale per Bacillus spp., Clostridium spp. e Listeria monocytogenes. Al fine di incrementarne l’efficacia, sono state valutate associazioni con altre sostanze naturali che hanno mostrato esplicare un'azione sinergica con la Nisina [xix].

Sono stati individuati i seguenti effetti:
• Aumento dell’azione inibitoria della nisina nei confronti dei batteri Gram⁺ in seguito a trattamenti combinati con oli essenziali (carvacrolo, timolo e carvone estratti rispettivamente da origano, timo e semi di cumino).

• Incremento dell’effetto della nisina e del carvone (estratto da cumino e aneto) nei confronti di Listeria monocytogenes, utilizzati in combinazione con lisozima.

• Aumento dell’effetto della nisina nei confronti dei batteri Gram⁺ in seguito all’addizione di esteri del saccarosio (emulsionanti).

• Aumento dell’azione della nisina utilizzata in combinazione con una batteriocina simile alla pediocina

• Prolungamento della shelf life di carne di manzo e pesce fresco mediante combinazione del trattamento con nisina con il confezionamento in atmosfera protetta.

• Aumento dell’azione della nisina utilizzata in combinazione con altri microrganismi protettivi in tofu e succhi di frutta

• Effetto sinergico di inattivazione di Bacillus cereus derivante dall'impiego combinato di nisina e di trattamenti con campi elettrici pulsati

• Permeabilizzazione della membrana esterna dei batteri Gram^– in associazione con EDTA e con esametafosfato di sodio (NaHMP)

SICUREZZA DI IMPIEGO  La Nisina è stata valutata e approvata come conservante alimentare per il controllo batterico (FAO/OMS 1969a), ed è identificato con il numero E234. Attualmente la Nisina è inserita nella categoria dei GRAS (Generally Recognized As Safe = generalmente riconosciuto come sicuro) da parte della FDA (Food and Drug Administration, USA)^5,[xx],[xxi]. Solo alcuni tipi di batteriocine mostrano lieve tossicità, ma anche in questi casi l’ingestione a lungo termine viene considerata priva di conseguenze sulla salute ²¹.

 

USO VETERINARIO Mediante una formulazione particolare (AMBICIN N) è stata utilizzata come germicida topico per la cura della mastite nelle mucche [xxii]^,[xxiii]. In questo studio, si è dimostrata efficace nell’inibire lo Staphylococcus aureus e l’ Escherichia coli dopo appena 1 minuto dalla applicazione. L’ azione battericida è risultata superiore ad una soluzione al 0.1 % di Iodofor (iodio complessato con detergenti idrosolubili e surfattanti) o 0.5 % di Clorexidina digluconato. Questa formulazione ad uso topico mostra piccola o nessuna irritazione cutanea dopo varie applicazioni mentre lo Iodofor e la Clorexidina digluconato danno maggior grado di irritazione. E’ stato quindi approvato dall’FDA²³ nella cura della mastite delle mucche, anche perchè non influisce la sicurezza del latte.

 

USO COSMETICO:  Non esistono ad oggi applicazioni cosmetiche significative, tranne che  in prodotti per l’igiene orale. Infatti, in uno studio si è dimostrata efficace nel combattere gengivite e placca (in un veicolo al 1 mM di EDTA sodico, 100 e 300 mg/ml di Nisina) comparandola con una soluzione al 0.12 % di clorexidina[xxiv]. Le sue proprietà unite alla grande sicurezza d’uso consentono però di auspicarne l’impiego per la conservazione di varie forme cosmetiche. L’unico limite è rappresentato dalla necessità di operare a pH prevalentemente acidi. L’INCI name/CTFA suggerito per questo prodotto è LACTOCOCCUS FERMENT.

 

ALTRE APPLICAZIONI. La Nisina per le sue caratteristiche amfifiliche e proprietà adsorbenti, unitamente alla non tossicità e attività antimicrobica si configura come un candidato interessante per essere impiegato come emulsionante per la preparazione di  emulsioni O/A, nell’industria alimentare, farmaceutica e cosmetica. Una valutazione sperimentale delle capacità emulsionanti e stabilizzanti della Nisina ha evidenziato una significativa capacità emulsionante, ma che si presenta fortemente dipendente dal pH e dalla concentrazione.

 

 

 

Prodotto	Potenza	Uso	Dosaggio
LFE-15000	12000~15000 IU/mg	Prodotti particolari	0,005-0,01 ppm
LFE-8000	8000~10000 IU/mg	Cosmetici	0,01-0,02 %
LFE-1000	1000 IU/mg	Derrate alimentari	0.1-0.5‰

 

 

Questa scheda informativa è stata redatta con la collaborazione scientifica di Stefano Manfredini, Professore Ordinario di Chimica Farmaceutica, Università di Ferrara. E’ vietata la riproduzione totale o parziale del testo e delle immagini senza una dichiarazione scritta di POLICHIMICA.

Le informazioni contenute nella seguente nota informativa sono allo stato attuale delle nostre conoscenze accurate e corrette. Esse vengono tuttavia offerte senza alcuna garanzia riguardo a possibili errori. In particolare non si assumono responsabilità per ciò che attiene alla loro applicazione.

 

 

RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

 

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